Белки-репортеры в гибридных белках. Белковая инженерия Получение и характеристика нового рекомбинантного одно доменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его биологическую активность

БЕЛКОВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ, направление молекулярной биологии и биоинженерии, в задачи которого входят целенаправленное изменение структуры природных белков и получение новых белков с заданными свойствами. Белковая инженерия возникла в начале 1980-х годов, когда были разработаны методы генетической инженерии, позволившие получать различные природные белки с помощью бактерий или дрожжей, а также определённым образом изменять структуру генов и, соответственно, аминокислотную последовательность (первичную структуру) кодируемых ими белков. Исходя из принципов организации белковых молекул, взаимосвязи структуры и функции белков, белковая инженерия создаёт научно обоснованную технологию направленного изменения их структуры. С помощью белковой инженерии удаётся повышать термостабильность белков, их устойчивость к денатурирующим воздействиям, органическим растворителям, изменять лигандсвязывающие свойства. Белковая инженерия позволяет путём замены аминокислот улучшать работу ферментов и их специфичность, изменять оптимальные значения pH, при которых работает фермент, исключать нежелательные побочные активности, устранять участки молекул, ингибирующие ферментативные реакции, повышать эффективность белковых лекарственных препаратов и так далее. Например, замена лишь одного остатка треонина на остаток аланина или пролина позволила в 50 раз повысить активность фермента тирозилтРНК-синтетазы, а благодаря замене 8 аминокислотных остатков так называемая термолизин-подобная протеаза из Bacillus stearothermophilus приобрела способность сохранять активность при 120 °С в течение нескольких часов. К белковой инженерии можно отнести также работы по направленному изменению свойств белков с помощью химических модификаций, например введение фотоактивируемых соединений, изменяющих свойства молекулы под действием света, соединений-меток, позволяющих отслеживать пути перемещения белка в клетке или направлять его к различным компонентам клетки, и тому подобное. Такие работы проводятся преимущественно на рекомбинантных белках, получаемых с помощью генно-инженерных методов.

В белковой инженерии можно выделить два направления: рациональный дизайн и направленная молекулярная эволюция белков. Первое подразумевает использование информации о структурно-функциональных отношениях в белках, получаемой с помощью физико-химических и биологических методов, а также компьютерного молекулярного моделирования, для того чтобы определить, какие именно изменения в первичной структуре должны привести к желаемому результату. Так, для повышения термостабильности белка необходимо определить его пространственную структуру, выявить «слабые» участки (например, аминокислоты, недостаточно сильно связанные со своим окружением), подобрать для них наилучшие варианты замен на другие аминокислоты с помощью молекулярного моделирования и оптимизации энергетических параметров молекулы; после этого подвергнуть мутации соответствующий ген, а затем получить и исследовать мутантный белок. Если этот белок не удовлетворяет заданным параметрам, проводят новый анализ и повторяют описанный цикл. Такой подход наиболее часто используется в случае конструирования искусственных белков (белков de novo) с заданными свойствами, когда на входе имеется новая аминокислотная последовательность, в основном или полностью заданная человеком, а на выходе - белковая молекула с желаемыми характеристиками. Пока, однако, таким образом удаётся получать только небольшие белки de novo с несложной пространственной структурой и вводить в них простые функциональные активности, например металлсвязывающие участки или короткие пептидные фрагменты, несущие какие-либо биологические функции.

При направленной молекулярной эволюции белков с помощью генно-инженерных методов получают большой набор различных мутантных генов целевого белка, которые затем экспрессируют специальным образом, в частности на поверхности фагов («фаговый дисплей») или в бактериальных клетках, с тем, чтобы сделать возможным отбор мутантов с лучшими характеристиками. С этой целью, например, гены нужного белка или его частей встраиваются в геном фага - в состав гена, кодирующего белок, расположенный на поверхности фаговой частицы. При этом каждый индивидуальный фаг несёт свой мутантный белок, обладающий определёнными свойствами, по которым делается отбор. Мутантные гены получают путём «перемешивания» набора генов сходных природных белков различных организмов, как правило, с помощью метода полимеразной цепной реакции, так что каждый получаемый мутантный белок может включать в себя фрагменты многих «родительских» белков. По сути, этот подход имитирует природную эволюцию белков, но только существенно более быстрыми темпами. Основная задача белкового инженера в данном случае заключается в разработке эффективной селектирующей системы, которая позволит отбирать лучшие мутантные варианты белков с нужными параметрами. В случае вышеупомянутой задачи — повысить термостабильность белка - отбор можно вести, например, путём выращивания клеток, содержащих мутантные гены, при повышенной температуре (при условии, что присутствие в клетке мутантного белка увеличивает её термическую устойчивость).

Оба названных направления белковой инженерии имеют одну цель и дополняют друг друга. Так, исследование получаемых с помощью методов молекулярной эволюции мутантных вариантов белков позволяет лучше понять структурно-функциональную организацию белковых молекул и использовать полученные знания для целенаправленного рационального дизайна новых белков. Дальнейшее развитие белковой инженерии даёт возможность решать многие практические задачи по улучшению природных и получению новых белков для нужд медицины, сельского хозяйства, биотехнологии. В будущем возможно создание белков, обладающих функциями, неизвестными в живой природе.

Лит.: Brannigan J.А., Wilkinson А.J. Protein engineering 20 years on // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. Vol. 3. № 12; Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. М., 2004. Т. 1: Генная и белковая инженерия.

Генетическая инженерия - конструирование in vitro функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК), или иначе - создание искусственных генетических программ (Баев А.А.). По Э.С. Пирузян генетическая инженерия - система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать лабораторным путем (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных или гибридных молекул ДНК.

Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний .

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

Специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

Быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

Конструирование рекомбинантной ДНК;

Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

Клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Конструирование рекомбинантных молекул осуществляется с помощью ряда ферментов – прежде всего ферментов рестрикции. В настоящее время используется свыше 400 различных рестриктаз. Эти ферменты синтезируют самые разнообразные микроорганизмы .

Рестриктазы узнают и расщепляют специфические нуклеотидные последовательности в двухцепочечной молекуле ДНК. Однако одних ферментов рестрикции при молекулярном клонировании недостаточно, так как водородные связи между четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, не столь прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК.

Одна часть рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, который предполагается клонировать, другая – содержит информацию, необходимую для репликации в клетке рекомбинантной ДНК.

Естественный отбор - движущая сила эволюции
Естественный отбор - это процесс, направленный на предпочтительное выживание более приспособленных и уничтожение менее приспособленных организмов. Более приспособленные особи имеют возможность оставить потомство. Материалом для отбора слу...

Выявление возбудителей брожения пектиновых веществ
Постановка опыта. Снопик льняной соломы высотой 6-7 см перевязывают в двух местах ниткой и вносят в пробирку лучше большего, чем стандартный, размера, наполненную на 2/3 водопроводной водой. Пробирку зажимают пинцетом и кипятят на горелк...

Переход от биосферы к ноосфере
Превращение разума и труда человечества в геологическую силу планетного масштаба происходило в рамках биосферы, составной частью которой они являются. В.И. Вернадский в своих исследованиях неизменно подчёркивал, какое огромное воздействие...

Белок в химическом отношении представляет собой однотипную молекулу, которая является полиаминокислотной цепочкой или полимером. Составлен он из аминокислотных последовательностей 20 типов. Узнав строение белков, люди задались вопросом: можно ли спроектировать абсолютно новые аминокислотные последовательности, чтобы они выполняли нужные человеку функции гораздо лучше, чем обычные белки? Для данной дерзкой идее лучше всего подошло название белковая инженерия .

О такой инженерии стали задумываться ещё в 50-е годы XX столетия. Случилось это сразу же после расшифровки первых белковых аминокислотных последовательностей. Во многих лабораториях мира начали делать попытки дублировать природу и синтезировать химическим путём заданные абсолютно произвольно полиаминокислотные последовательности.

Больше всех в этом преуспел химик Б. Меррифилд. Этому американцу удалось разработать чрезвычайно эффективный метод синтеза полиаминокислотных цепей. За это Меррифилду в 1984 году присудили Нобелевскую премию по химии.

Американец начал синтезировать короткие пептиды, включая гормоны. При этом построил автомат - «химического робота» - в задачу которого входило производит искусственные белки. Робот вызвал сенсацию в научных кругах. Однако скоро выяснилось, что его продукция не может конкурировать с тем, что производит природа.

Робот не мог в точности воспроизводить аминокислотные последовательности, то есть ошибался. Он синтезировал одну цепь с одной последовательностью, а другую уже с чуть-чуть другой. В клетке же все молекулы одного белка идеально похожи друг на друга, то есть их последовательности абсолютно одинаковые.

Была и ещё одна проблема. Даже те молекулы, которые робот синтезировал правильно, не принимали ту пространственную форму, которая необходима для функционирования фермента. Таким образом, попытка подменить природу обычными методами органической химии привела к весьма скромному успеху.

Учёным оставалось учиться у природы, выискивая нужные модификации белков. Тут дело в том, что в природе постоянно идут мутации, ведущие к изменению аминокислотных последовательностей белков.

Если отобрать мутантов с необходимыми свойствами, скажем более эффективно перерабатывающих тот или иной субстрат, то можно выделить из такого мутанта измененный фермент, благодаря которому клетка приобретает новые свойства. Но данный процесс занимает очень большой период времени.

Все изменилось тогда, когда появилась генная инженерия . Благодаря ей, стали создавать искусственные гены с любой последовательностью нуклеотидов. Эти гены встраивали в приготовленные молекулы-векторы и внедряли эти ДНК в бактерии или дрожжи. Там с искусственного гена снималась копия РНК. В результате этого вырабатывался нужный белок. Ошибки в его синтезе исключались. Главное, надо было подобрать нужную последовательность ДНК, а дальше уже ферментная система клетки сама безупречно делала своё дело.

Таким образом, можно заключить, что генная инженерия открыла путь белковой инженерии в самой радикальной форме. К примеру, мы выбрали белок и захотели заменить в нём один аминокислотный остаток на другой.

Прежде чем начать работу по замене, необходимо приготовить ДНК-вектор. Это вирусная или плазмидная ДНК со встроенным в неё геном того белка, который нас интересует. Нужно также знать нуклеотидную последовательность гена и аминокислотную последовательность кодируемого белка. Последняя определяется из первой при помощи таблицы генетического кода.

С помощью таблицы также легко установить, какие минимальные изменения следует произвести в составе гена, чтобы он начал кодировать не исходный, а изменённый по нашему желанию белок. Допустим, в середине гена нужно гуанин заменить на тимин.

Из-за такой мелочи не нужно заново синтезировать весь ген. Синтезируется лишь небольшой фрагмент нуклеотидов, комплементарный участку, в середине которого располагается выбранный для замены нуклеотид гуанин.

Полученный фрагмент смешиваем с ДНК-вектором (кольцевая ДНК), в которой содержится нужный нам ген. Кольцо ДНК и синтезированный фрагмент создают участок уотсон-криковской двойной спирали. В нём центральная пара «выпихивается» из двойной спирали, так как она образована взаимно некомплементарными нуклеотидами.

Добавляем в раствор четыре дНТФ и ДНК-полимеразу. Последняя, используя налипший на одиночное кольцо фрагмент, достраивает его до полного кольца в полном соответствии с принципом комплементарности.

В результате у нас получается почти нормальная векторная ДНК. Её можно ввести в дрожжевую или бактериальную клетку для размножения. Единственное, эта ДНК отличается от исходного вектора некомплементарной парой. Иными словами, спираль ДНК-вектора совершенна не полностью.

При первом же акте удвоения полученного вектора вместе с несущей его бактерией, каждая из дочерних молекул ДНК станет совершенной двойной спиралью на всём своём протяжении. Однако одна из дочерних молекул несёт в себе исходную нуклеотидную пару, а у другой в этом месте находится мутантный вектор, на основе которого и получается интересующий нас мутантный белок.

Таким образом, белковая инженерия создаёт смесь клеток. Одни из них несут исходный вектор с немутантным геном, а другие клетки несут мутантный ген. Остаётся отобрать из этой смеси именно те клетки, в которых находится мутантный ген .

Белковая инженерия 6 Комплекс методов и подходов по изучению белков и получению белков с новыми свойствами ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ Создать клонотеку нуклеотидных и аминокислотных последовательностей Исследовать влияния одиночных замен аминокислотных остатков на фолдинг и функции белка Разработать методы эффективной модификации белков для придания им необходимых свойств Разработать методы и подходы для скрининга и отбора белков с требуемыми свойствами

Рациональныйдизайн Рациональный дизайн Необходимость знаний о пространственной организации белка Необходимость знаний о внутри- и межмолекулярных взаимодействиях Несовершенство методик и аппаратуры направление, нацеленное на создание новых белков de novo путем их пространственного конструирования

Направленная эволюция белковых молекул направление, нацеленное на создание новых белков, посредством селекции 1 получение клонотек случайных аминокислотных последовательностей 2 отбор полипептидных цепей, обладающих хотя бы в небольшой степени требуемыми свойствами 3 с использованием случайного мутагенеза получение новых клонотек белков, которые применяют в следующем раунде селекции или с использованием генно-инженерных конструкций, экспрессирующих новые белки

Направленная эволюция белковых молекул (варианты) рациональный редизайн с помощью направленного мутагенеза заменяют конкретные аминокислотные остатки в активном центре фермента инженерия белковых поверхностей с помощью мутаций изменяют участки полипептидной цепи в окрестностях аминокислотных остатков, сближенных на поверхности белковой глобулы, но находящихся в полипептидной цепи на значительном расстоянии друг от друга

Скрининг и отбор белков с заданными свойствами случайный скрининг улучшенный скрининг отбор каждый белок исследуется на наличие требуемых свойств; выбор белков из клонотеки происходит случайно каждый белок исследуется на наличие требуемых свойств; выбор белков из клонотеки происходит случайно возможен, если объекты, составляющие клонотеку, различаются фенотипически (например, по наличию ферментативной активности) создаются условия для избирательного сохранения компонентов клонотеки, которые обладают определенными свойствами (фаговый, клеточный дисплей) создаются условия для избирательного сохранения компонентов клонотеки, которые обладают определенными свойствами (фаговый, клеточный дисплей) обнаружение белка с требуемыми свойствами среди большого числа макромолекул, составляющих полученную клонотеку

Фаговый дисплей Цель – экспонировать чужеродные белки на поверхности фага Метод был разработан в 1985 г. для нитчатого бактериофага М13. (гены pIII и pVIII являются пригодными сайтами мишенями для вставки чужеродного кДНК фрагмента) Цель – экспонировать чужеродные белки на поверхности фага Метод был разработан в 1985 г. для нитчатого бактериофага М13. (гены pIII и pVIII являются пригодными сайтами мишенями для вставки чужеродного кДНК фрагмента) конструируют гибридный ген, состоящий из кодирующих последовательностей целевого белка и одного из белков оболочки фага бактериофагом инфицируют E.coli в ходе сборки фага гибридные белки включаются в фаговую частицу

Фагмида Фаг-помощник Геном фага Инфицирование E.coli фагом-помощником клетки E.coli, трансформированные плазмидной библиотекой / фагмидой, инфицируют хелперным фагом для получения фаговых частиц, на поверхности которых экспонированы различные варианты целевого белка клетки E.coli, трансформированные плазмидной библиотекой / фагмидой, инфицируют хелперным фагом для получения фаговых частиц, на поверхности которых экспонированы различные варианты целевого белка

Перспективы практического использования белковой инженерии Медицина: *для получения новых лекарственных препаратов; для создания диагностических средств и производства вакцин; *для исследование механизмов иммунного ответа, а также заболеваний иммунной системы Экология: *для получение биокатализаторов в виде целых клеток с иммобилизованными на их поверхности ферментами; *для получения биосенсоров с целью диагностики и мониторинга окружающей среды; *для создание био адсорбентов с целью удаления из окружающей среды токсических веществ и ионов тяжелых металлов

Измерение глюкозы с помощью ферментного электрода (схематическое представление опыта Л. Кларка). Окисление глюкозы ферментом глюкозооксидазой в присутствии кислорода: глюкоза + О 2 Н 2 О 2 + глюконо-1,5-лактон. Н 2 О 2 восстанавливается на платиновом электроде при потенциале +700 мВ; протекающий в цепи ток пропорционален концентрации пероксида водорода (т.е., косвенно, глюкозы).

В рассмотренных выше библиотеках пептидов последние ковалентно связаны с белком-носителем. В таком виде они являются одними из представителей гибридных белков, получаемых методами генной инженерии.

В другом случае гибридные белки применяют для получения высокого уровня экспрессии коротких пептидов в бактериальных клетках благодаря стабилизации этих пептидов в составе гибридных белков. Часто гибридные белки используют для идентификации и очистки трудноопределяемых рекомбинантных белков. Например, присоединив к С-концу исследуемого белка в качестве белка-репортера -галактозидазу, можно производить очистку рекомбинантного белка по активности -галактозидазы, определяя ее антигенные детерминанты иммунохимическими методами. Соединяя фрагменты ДНК, содержащие открытые рамки считывания (ОРС), с генами белков-репортеров, можно очистить такие гибридные белки по активности белка-репортера и использовать их для иммунизации лабораторных животных. Полученные антитела далее применяют для очистки нативного белка, в состав которого входит рекомбинантный полипептид, кодируемый ОРС, и тем самым идентифицируют клонированный фрагмент гена.

С помощью гибридных белков решают и обратную задачу клонирования неизвестного гена, к белковому продукту которого имеются антитела. В таком случае конструируют клонотеку последовательностей нуклеотидов, представляющих ОРС неизвестных генов, в векторах, которые позволяют соединять клонируемую ОРС в одной рамке считывания с геном-репортером. Образующиеся в результате экспрессии этих рекомбинантных генов гибридные белки идентифицируются с помощью антител иммуноферментными методами. Гибридные гены, объединяющие секретируемые белки и белки-репортеры, дают возможность по-новому исследовать механизмы секреции, а также локализацию и перемещение в тканях секретируемых белков.

1. Гибридные токсины

Серия работ И. Пастана с сотрудниками по конструированию гибридных токсинов направленного действия прекрасно иллюстрирует возможности белковой инженерии в части комбинирования различных функциональных доменов белков для достижения конкретных биологических эффектов.

Рис. II.22. Лекарственные препараты направленного действия на основе гибридных токсинов

а – обобщенная схема структуры лекарственного препарата направленного действия;б – строение псевдомонадного токсина (цифрами обозначено положение аминокислотных остатков);в – строение гибридного токсина;г – гибридный токсин на основе моноклональных антител

Идеальное лекарственное средство строго специфического избирательного действия должно обладать, по крайней мере, следующими структурно-функциональными особенностями (рис. II.22,а ). Такой лекарственный препарат должен заключать в себе действующее начало для достижения физиологического эффекта и лиганд, распознающий рецептор на поверхности клеток-мишеней. Кроме того, в нем должны быть структурные элементы, распознаваемые системой транспорта организма, для доставки лекарства к клеткам-мишеням, а также спейсерный участок, необходимый для отделения действующего начала от остальных функциональных частей препарата после его доставки по адресу. Именно такая идеальная схема реализуется в природном экзотоксине Pseudomonas aeruginosa. Экзотоксин А P. aeruginosa представляет собой белок, состоящий из одной полипептидной цепи длиной в 613 аминокислот, которая организована в три функциональных домена (см. рис. II.22,б ). N-Концевой домен Ia (аминокислотные остатки 1–252) необходим для взаимодействия с поверхностью клеток-мишеней (прототип лиганда идеального лекарства направленного действия). Функции домена Ib (аминокислотные остатки 365–404) в настоящее время неизвестны. Домен II (аминокислотные остатки 253–364) обеспечивает эффективный перенос токсина в цитозоль клеток (система транспорта лекарства), а домен III (аминокислотные остатки 405–613) осуществляет ADP-рибозилирование фактора элонгации трансляции EF2, что приводит к подавлению трансляции и гибели клеток-мишеней. Таким образом, для оказания цитотоксического действия экзотоксину A необходимо с помощью домена Iа распознать рецепторы на поверхности клеток, проникнуть в клетку с помощью эндоцитоза, опосредованного рецепторами, и быть транслоцированным через внутреннюю мембрану в цитозоль, где локализуется фактор EF2. Основная идея в создании токсинов направленного действия заключалась в том, чтобы заменить домен Iа на какой-либо иной пептидный лиганд, взаимодействующий с другой группой рецепторов на поверхности клеток, и тем самым изменить специфичность действия токсина в отношении самих клеток (см. рис. II.22,в ).

Было установлено, что удаление домена Iа генно-инженерными методами резко (в сотни и тысячи раз) снижает токсичность такого укороченного белка как в отношении клеток различных линий, так и in vivo. Присоединение к С-концевой части укороченного полипептида молекулы интерлейкина 2 человека осуществляли путем объединения структурных частей соответствующих генов в экспрессирующем векторе. Очищенный гибридный токсин оказался чрезвычайно токсичным в отношении клеток, несущих на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, и не действовал на клетки, у которых эти рецепторы отсутствовали и которые погибали под действием природного токсина. Интернализация (транслокация внутрь клеток) гибридного токсина была опосредована субъединицами р55 и р70 рецептора интерлейкина 2. Таким образом, в результате действия гибридного токсина на популяцию клеток, часть из которых экспрессирует на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2, происходит избирательная гибель именно этих клеток.

В организме большинство покоящихся T-клеток и T-клеток памяти не экспрессируют на своей поверхности высокоаффинных рецепторов интерлейкина 2, тогда как T-клетки, стимулированные аллоантигенами, содержат такие рецепторы. Поэтому внутрибрюшинное введение гибридного токсина крысам с экспериментальным артритом – заболеванием, обусловленным патологической активацией T-клеток, снижало симптомы заболевания. Гибридный токсин существенно уменьшал у мышей и реакции отторжения трансплантата.

Вслед за этими пионерскими работами последовала целая серия исследований, направленных на создание аналогичных систем адресной доставки различных цитотоксических полипептидов. В процессе дальнейшего усовершенствования системы адресной доставки псевдомонадного токсина с использованием интерлейкина 2 в качестве лиганда отказались от полного удаления адресного домена токсина и ограничились его инактивацией путем введения в ген токсина четырех сайт-специфических мутаций. Молекулы такого гибридного токсина оказались в 10–100 раз более эффективными цитотоксическими агентами против клеток человека и обезьян, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы для интерлейкина 2, а также обладали значительно большим временем полужизни в крови мышей in vivo по сравнению с ранее полученной конструкцией.

На основе псевдомонадного токсина были созданы гибридные токсины, содержащие в качестве лигандов полипептидные цепи интерлейкина 4, интерлейкина 6, трансформирующего фактора роста типа  и инсулиноподобного фактора роста I. Для всех этих гибридных белков была показана высокоспецифическая цитотоксичность в отношении опухолевых клеток (включая клетки миеломы человека), обладающих соответствующими рецепторами. Использование в гибридном токсине в качестве лиганда части полипептидной цепи CD4 – гликопротеина поверхности T-клеток, который является рецептором вируса ВИЧ и взаимодействует с его гликопротеином gp120, позволило избирательно поражать T-клетки, зараженные вирусом ВИЧ и экспрессирующие на своей поверхности вирусный белок gp120.

Тот же принцип подавления инфекции, вызванной вирусами ВИЧ, растворимыми рецепторами CD4 был использован при конструировании гибридных белков, объединяющих части полипептидных цепей CD4 с константными частями тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов человека. При этом в процессе объединения генов были удалены последовательности нуклеотидов, кодирующие трансмембранный и цитоплазматический домены CD4, а также вариабельную часть полипептидных цепей иммуноглобулинов. Образующиеся гибридные молекулы, названные иммуноадгезинами , за счет константной части молекулы иммуноглобулина приобретали повышенную стабильность в организме и, кроме того, сохраняли специфические свойства, опосредуемые константными частями иммуноглобулинов: связывание Fс-рецептора и белка A, способность к фиксации комплемента и перенос через плацентарный барьер. Совокупность всех этих свойств давала возможность иммуноадгезинам эффективно прерывать инфекцию T-клеток вирусом ВИЧ-I, блокируя как сам вирус, так и зараженные им клетки, экспрессирующие на своей поверхности вирусный антиген gp120.

Дальнейшее усовершенствование генно-инженерных конструкций на основе псевдомонадного экзотоксина А произошло после того, как в качестве адресной части гибридного токсина стали использовать вариабельные домены моноклональных антител к компоненту p55 рецептора интерлейкина 2 человека. В этом рекомбинантном белке с помощью 15-звенного пептидного линкера аминокислот соединяли вариабельный домен тяжелой цепи этого иммуноглобулина с вариабельным доменом его легкой цепи, а С-конец легкой цепи – с N-концом укороченного псевдомонадного токсина (см. рис. II.22,г ). Такие молекулы гибридного токсина также оказались высокоспецифичными цитотоксическими агентами по отношению к лейкозным клеткам человека, экспрессирующим на своей поверхности рецепторы интерлейкина 2.

Разработанный подход продемонстрировал возможность использования специфических антител в качестве адресных частей гибридных токсинов. Это дает в руки исследователей универсальный способ адресной доставки токсинов, который в будущем позволит оказывать цитотоксическое действие на любые группы клеток, экспрессирующих на своей поверхности специфические антигены, т.е. значительно расширить количество мишеней для химиотерапевтических воздействий с использованием рекомбинантных белков.

Помимо псевдомонадного экзотоксина A в качестве действующего начала в гибридных токсинах успешно применяли дифтерийный токсин, фактор некроза опухолей и A-цепь рицина. Поскольку A-белок избирательно взаимодействует с константными (Fс) частями иммуноглобулинов класса G многих млекопитающих, такой гибридный токсин в паре с иммуноглобулином, полученным против какого-либо антигена на поверхности клеток, избирательно связывается с этими клетками и убивает их. Такие иммунотоксины являются еще одним потенциальным противоопухолевым агентом и могут быть использованы против клеток, экспрессирующих на своей поверхности специфические антигены.

Рис. II.23. Использование гибридного белка для регуляции экспрессии гена

Методы генной инженерии открывают безграничные возможности конструирования новых белков путем объединения в разных комбинациях различных функциональных доменов полипептидных цепей. Получение гибридных токсинов направленного действия иллюстрирует возможности такого подхода в белковой инженерии. В качестве последней иллюстрации возможностей этой группы методов рассмотрим гибридный белок как новый регулятор активности генов. При конструировании такого белка методами генной инженерии был заменен ДНК-связывающий домен в рецепторе глюкокортикоидных гормонов на соответствующий домен LexA-репрессора E. coli (рис. II.23).

Введение операторной последовательности гена lexA в область промотора глобинового гена (или других генов) приводило к активации промотора под действием гибридного белка в присутствии дексаметазона – синтетического гормона, взаимодействующего с рецептором глюкокортикоидов. Таким образом, в новом генетическом окружении последовательность нуклеотидов оператора гена lexA E. coli функционировала в качестве энхансера транскрипции в присутствии гибридного белка-активатора, узнающего эту последовательность. Результаты работы демонстрируют возможность создания новых белков – регуляторов активности генов путем комбинирования известных функциональных доменов.

Развитие белковой инженерии во многом сдерживается недостатком знания о структурно-функциональных взаимоотношениях в белках, что обусловлено сложностью объекта исследования. Многочисленные работы, направленные на изучение таких связей, как правило, носят эмпирический характер и завершаются локализацией аминокислот, существенных для функционирования активных центров ферментов. Поэтому основная задача белковой инженерии – по известной последовательности аминокислотных остатков получить белок с заданными свойствами – в настоящее время еще далека от своего разрешения. Тем не менее, уже сейчас иногда удается целенаправленно изменять некоторые свойства существующих ферментов путем замен небольшого числа аминокислотных остатков их полипептидных цепей с помощью направленного мутагенеза.